京都大学　再生医科学研究所
　　　　　幹細胞研究部門
　　　　　幹細胞分化制御研究分野　
 

京都大学
iPS細胞研究所
増殖分化機構研究部門

幹細胞分化制御研究領域 Laboratory of Stem Cell Differentiation �T．研究活動 　[研究概要] 　幹細胞分化制御研究領域では、ES細胞（胚性幹細胞：embryonic stem cells）及びiPS細胞（人工多能性幹細胞：induced pluripotent stem cells）を用いて、心血管系の細胞分化・再生に関する研究を行っている。 ES細胞は、全ての種類の細胞に分化することができるいわゆる「万能」幹細胞と考えられている。この全能性(pluripotency)をin vitroにおいて引き出し、分化誘導した細胞を再生治療に用いようとする試みが様々な臓器、細胞をターゲットに行われている。我々は、ES細胞を用いて中胚葉由来組織である血管および心臓の分化研究を行ってきた。 血管は、内腔を一層におおう内皮細胞とそれを外から取りまく壁細胞の２種類の細胞からなっている。その中を流れる血球細胞を含めてこれら血管構成細胞は互いに密接に連関しあい血管を形作る。VEGFの受容体の一つであるFlk1は血球・血管系細胞の最も早期の分化マーカーおよび中胚葉のマーカーと考えられている。我々は、ES細胞を用いてin vitroにおいて中胚葉、さらには血管の構成細胞である血管内皮細胞と壁細胞（血管平滑筋細胞およびペリサイト）を選択的に分化誘導し、最終的に血管としての高次構造をin vitroおよびin vivoにおいて構築すること、いわば血管の発生過程を再現することに成功した(Yamashita, Nature, 2000.)。このin vitro分化系では、Flk1陽性細胞を共通の前駆細胞として、内皮細胞、壁細胞、血球細胞が分化し、さらにそれらの細胞が血管としての高次構造を形成する。また、中胚葉由来の細胞の一つである心筋細胞も同様にFlk1陽性細胞から分化誘導することと共に新しい心筋前駆細胞の同定に成功している (Yamashita, FASEB J, 2005)。動静脈リンパ管内皮細胞分化や心筋ペースメーカー細胞などさらに多様な心血管細胞の分化誘導を行っている (Yamashita, Trends Cardiovasc Med, 2007; Yanagi, Stem Cells, 2007他)（図）。最近我々は、免疫抑制剤のサイクロスポリンAがFlk1陽性中胚葉細胞に特異的に作用し、心筋前駆細胞及び心筋細胞の分化を促進する、という全く新しい作用を見出した(Yan, Biochem Biophys Res Commun, 2009)。本研究をもとに心筋細胞の効率的分化を誘導する低分子化合物の探索を行っている。また、血管内皮細胞分化を培養下において構成的に再現することにより、cAMPシグナルの意義を次々に明らかにした。すなわち、Protein kinase Aが血管前駆細胞のVEGFへの感受性を変化させて内皮細胞分化を促進していること(Yamamizu, Blood, 2009)、同作用がCREBによる転写因子Etv2発現誘導によること(Yamamizu, Stem Cells, in press)、痛覚に関与するオピオイドがcAMPシグナルを抑制することにより内皮分化・血管形成に抑制的に作用していること(Yamamizu, Blood, 2011表紙)、及びNotchとβ-cateninが直接相互作用することにより動脈内皮への運命決定を行っていることを新たに示した(Yamamizu, J Cell Biol, 2010)。 さらに、最近本研究所山中伸弥教授によって樹立された人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いて同様の実験システムを構築し、新たな心血管再生研究を開始している。ES細胞研究において蓄積したノウハウを用いていち早くマウスiPS細胞を用いた心血管系細胞の分化誘導に成功した(Narazaki, Circulation, 2008)。またサイクロスポリンAの作用を応用し、ヒトiPS細胞からの機能心筋細胞を誘導することにも成功した(Fujiwara, PLoS One, 2011)。さらに高効率な新しいヒトiPS細胞の心筋分化法と誘導心筋細胞の純化法の開発にも成功した(Uosaki, PLoS One, 2011)。 このように我々のES細胞を用いたin vitro分化系は、種々の循環器系の細胞群を系統的に分化誘導することができ、心血管の発生分化過程を培養下に恣意的に操作しながらしかも経時的に観察できる。従って、この分化系を用いることにより心臓血管の発生分化のメカニズムを細胞レベル、分子レベルで検討し、ノックアウトマウスの形質解析に依存していた分化の分子機構の解析をin vitroで行うという新しいアプローチが可能になったと考えられた。またこれらの知見を様々な形で再生医療を中心とした応用研究に展開することができる。 現在、このES細胞in vitro分化系を用いて、以下のようなプロジェクトを遂行及び予定している。 ES細胞/iPS細胞in vitro分化系を用いた心血管細胞分化多様化の分子機構の解析 DNAチップを用いた網羅的心血管分化関連遺伝子の同定 RNA干渉を用いたin vitro遺伝子機能解析系の構築 (Hiraoka-Kanie, Biochem Biophys Res Commun, 2006) 動静脈・リンパ管内皮特異的分化誘導と内皮細胞多様化機構の解析 (Yurugi-Kobayashi, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006; Kono, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006; Yamashita, Trends Cardiovasc Med, 2007; Yamamizu, J Cell Biol, 2010) cAMP及びPKAによる血管内皮細胞の分化能調節機構(Yamamizu, Blood, 2009; Yamamizu, Stem Cells, in press) 血管内皮分化及び血管形成におけるオピオイドの意義(Yamamizu, Blood, 2011表紙)（星薬科大学との共同研究） 物理的刺激の血管内皮分化多様化における意義（Yamamoto, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005）（東京大学との共同研究） ES/iPS細胞分化過程におけるエピジェネティクス解析（東京大学との共同研究） 誘導血管細胞の血管再生への応用 移植ドナー細胞の最適な分化段階の決定 (Yurugi-Kobayashi, Blood, 2003)。 人工生体材料を用いたハイブリッド人工血管（Huang, J Artif Organ, 2005）。 ES細胞/iPS細胞からの心筋細胞の分化誘導と再生治療応用 ２次元培養による新しいES細胞からの心筋細胞分化誘導法の開発と新しい心筋前駆細胞の同定（Yamashita, FASEB J, 2005）。 心筋細胞in vitro分化系を用いた心筋分化・多様化の分子機構の解析 ES細胞由来心筋細胞自動能形成機構の解析(Yanagi, Stem Cells, 2007) サイクロスポリンAを用いた新しい高効率心筋前駆細胞・心筋細胞分化誘導法(Yan, Biochem Biophys Res Commun, 2009)（京都大学心臓血管外科との共同研究） 新しい心臓再生治療への応用。i) 心筋前駆細胞移植。ii) ES/iPS細胞由来心血管細胞を用いた心組織シート移植（東京女子医大・京都大学心臓血管外科との共同研究） サルES細胞からの血管分化誘導 サルES細胞からの血管分化誘導に成功した(Sone, Circulation, 2003) （京都大学臨床病態医科学との共同研究） 7）ヒトES細胞からの血管分化誘導 京都大学臨床病態医科学申請の輸入ヒトES細胞を用いた血管分化研究に参画 (Sone, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007; Yamahara, PLoS One, 2008)。 8）ヒトES細胞からの心筋細胞分化誘導 ヒトES細胞使用計画「ヒトES細胞を用いた心血管細胞分化機構に関する研究」（研究代表者・山下　潤、平成17年3月10日文部科学大臣承認） ヒトES細胞を用いた心血管分化研究を行っている。 マウスiPS細胞を用いた心血管分化系の構築 (Narazaki, Circulation, 2008; Best Paper Award in Basic Science category, Circulation 2008) ヒトiPS細胞からの心筋細胞分化誘導法の開発 サイクロスポリンA法の応用(Fujiwara, PLoS One, 2011)。（臨床病態医科学との共同研究） 新しい高効率心筋分化誘導法の開発とVCAM1を表面抗原として用いた新しい心筋細胞純化法の開発(Uosaki, PLoS One, 2011) ヒトiPS細胞分化における心筋前駆細胞の誘導と純化 iPS細胞分化システムのケミカルバイオロジー及び創薬応用 (Nakao, Bioorg Med Chem Lett, 2008)（早稲田大学他との共同研究） 心筋細胞分化・増殖を促進する新しい化合物の探索・同定